【摘要】 目的 分析在薄层液基细胞制片上改良抗酸染色的阳性检出率。方法 选取128例结核患者， 标本种类为胸腹水、支气管灌洗液、痰、心包积液及脑脊液， 薄层液基细胞制片后分别采用改良抗酸染色方法、传统抗酸染色方法及实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）结核检测方法， 对细胞标本三种检测结果进行比较。结果 薄层液基细胞制片改良抗酸染色的阳性率为49.2%， 明显高于传统抗酸染色阳性率的33.6%， 差异具有统计学意义（χ2=6.440， P<0.05）。薄层液基细胞制片实时荧光定量PCR与传统抗酸染色阳性率比较， 差异无统计学意义（χ2=1.667， P>0.05）。薄层液基细胞制片改良抗酸染色检测阳性率高于实时荧光定量PCR， 但差异无统计学意义（χ2=1.576， P>0.05）。结论 对于早期结合患者，薄层液基细胞制片改良抗酸染色的检测阳性率明显较高， 是一种早期诊断结核的可靠有效方法。
【关键词】 改良抗酸染色；早期结核；诊断价值
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.22.017
在临床工作中早期结核疾病诊断是临床医生棘手的问题之一， 随着艾滋病、免疫抑制剂的应用及结核耐药菌株出现， 结核的发病率明显上升， 与其他疾病相比早期结核的临床症状日趋不典型性， 易引起临床预估不准， 导致初步诊断时遗漏病变或误诊肿瘤性疾病， 结核的早期诊断对临床治愈具有十分重要意义， 抗酸染色操作简单， 检测时间短， 被公认为诊断结核的有效使用方法， 但目前阳性率偏低， 困扰临床推广及应用， 如何提高抗酸染色的阳性率一直是病理医生研究的课题之一， 本项科研课题主要研究液基细胞标本应用改良抗酸染色方法确定结核诊断， 与传统抗酸染色及PCR检测结核的方法进行比较， 进行早期结核的诊断阳性率分析。
1 材料与方法
1. 1 材料来源 选取本院2015年3月～2016年10月的128例结核患者为检测对象， 其中男80例， 女48例， 年龄19～97岁， 平均年龄47岁， 标本种类为胸腹水、支气管灌洗液、痰、心包积液及脑脊液。
1. 2 方法 薄层液基细胞制片后分别采用改良抗酸染色方法、传统抗酸染色方法及实时荧光定量PCR结核检测方法。
1. 2. 1 实时荧光定量PCR检测方法 应用Eppdorf荧光定量PCR仪， 取单管单人份PCR反应管3份， 直接加入处理后样品、阴性质控品及阳性质控品2 µl， 8000 rpm离心数秒， 放入PCR仪扩增， 扩增条件：93℃2 min預变性， 93℃45 s～55℃120 s， 反应10个循环后置33℃保温， 迅速逐个将反应管放入荧光检测仪， 最后93℃45 s～55℃120 s， 共做30个循环后置33℃保温。
1. 2. 2 改良抗酸染色及传统抗酸染色方法 操作步骤：新柏氏2000薄层液基细胞制片， 滴入苯酚碱性品红液， 微波炉中低火8 min（传统方法：滴入苯酚碱性品红液室温30 min）， 20%硫酸水溶液分化1～5 min， Mayer苏木素复染。
1. 3 阳性检测标准
1. 3. 1 结核PCR阳性标准 在实验有效的前提下， 结核PCR检测阳性AxP1-N）， 如果P1-N）>AxP1-N）则属于实验灰度区， 需重复实验1次， 若重复结果AxP1-N）应用判为阳性， 否则为阴性。
1. 3. 2 抗酸染色阳性标准 采用萋尼氏染色法（Z-N）镜检结果分级报告标准， 抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野， 未发现抗酸杆菌。抗酸杆菌阳性， 报告抗酸杆菌菌数：1～8条抗酸杆菌/300视野或抗酸杆菌阳性（1+）， （2+）， （3+）， （4+）均视为阳性。
1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行处理。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 薄层液基细胞制片改良抗酸染色及传统抗酸染色方法检测结果比较 薄层液基细胞制片改良抗酸染色的阳性率为49.2%， 明显高于传统抗酸染色阳性率的33.6%， 差异具有统计学意义（χ2=6.440， P<0.05）。见表1。
2. 2 薄层液基细胞制片实时荧光定量PCR与传统抗酸染色检测结果比较 薄层液基细胞制片实时荧光定量PCR与传统抗酸染色阳性率比较， 差异无统计学意义（χ2=1.667， P>0.05）。见表2。
2. 3 薄层液基细胞制片改良抗酸染色与实时荧光定量PCR检测结果比较 薄层液基细胞制片改良抗酸染色检测阳性率高于实时荧光定量PCR， 但差异无统计学意义（χ2=1.576， P>0.05）。表3。
3 讨论
世界卫生组织全球结核病最新报告指出， 2013年全球约有900万例活动性结核病患者， 150万例病死。中国结核病发病率仅次于印度及俄罗斯， 特别是耐药结核的出现， 严重影响人们的健康及经济发展[1， 2]。用于结核诊断的方法中细菌学检测需要时间长， 生物安全级别要求较高， 血清学试验检测结核抗原或抗体不太理想。实时荧光定量PCR结核探针检测结核杆菌的存在， 特异性比较高， 但敏感性不理想， 主要是目前结核分枝杆菌的基因变异性较大， 检测时间较长， 目前临床医生仍以抗酸染色为结核检测。 临床上和流行病学中常用查见抗酸杆菌作为结核病诊断的依据[3]， 随着临床医疗水平的提升， 典型结核疾病易于临床诊断， 能得到及时有效治疗， 但目前结核临床症状呈现不典型性， 导致错过最佳治疗阶段， 早期结核疾病的诊断尤为重要。无创及微创下痰、 尿、 穿刺组织液、 胸腹水等液基细胞为早期结核诊断提供理想标本， 此方法操作简单， 经济快速制片， 分枝杆菌富集效果好， 提高抗酸染色阳性率是本次科研课题的主要研究目的。
本次实验采集临床确诊结核患者的痰检、 支气管刷检， 肺泡灌洗液、 胸腹水、 心包积液等标本， 128例液基细胞制片后分别进行传统抗酸染色及改良抗酸染色方法， 同一病例实时荧光定量PCR应用结核探针进行检测， 对三种实验方法的结果进行比较分析， 三种方法（改良抗酸染色、传统抗酸染色及实时荧光定量PCR检测）阳性率分别为49.2%， 33.6%， 41.4%， 前两种检测阳性率比较差异具有统计学意义（P<0.05）， 改良抗酸染色与实时荧光定量PCR检出阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）， 改良抗酸染色阳性率稍高于实时荧光定量PCR阳性率， 操作简单经济， 仍然视为结核检测首选方法。实时荧光定量PCR检测结核的特异性非常高， 实时荧光定量PCR技术可以检出组织中结核分枝杆菌[4]， 但不能同时检测出非结核分枝杆菌， 本实验结果比王旭洲等[5]荧光定量 PCR检测阳性率（51.50%）低。Agarwal等[6]报道如果标本处理不当或检测程序不规范， 有可能会造成假阴性或者假阳性， 本次实验结核探针PCR检测的阳性率可能与此类因素有关。传统抗酸染色的阳性率明显低于改良抗酸染色， 本研究结果明显高于杨铭等[7]报道的 16.33%， 本次实验的传统抗酸染色与改良抗酸染色阳性率均有增高， 可能与标本制片程序较少、 细菌富集有关。
病理组织切片经过固定、脱水、浸蜡等程序易对结核杆菌造成破坏， 而液基细胞制片相对操作程序较少， 抗酸染色阳性结核分枝杆菌形态明显易见。此种方法把液基细胞技术与改良抗酸染色有机结合， 一方面在无创及微创下易于采集到早期诊断结核疾病的理想标本， 易于被患者接受；另一方面此种实验方法明显提高早期结核诊断阳性率， 检测时间短， 成本较低， 操作简单， 最适合基层医院推广的早期结核检测最佳方法。
目前抗酸染色阳性被认为是诊断结核的金标准， 查找文献有研究報道目前存在非结核分枝杆菌在抗酸染色阳性时镜下形态十分相似， 因此， 在抗酸染色阳性的病例必须结合临床特征及相应检查结果明确诊断。
综上所述， 在液基细胞制片下改良抗酸染色是目前检测早期结核的易于患者接受、 有效的检测方法， 能明显提高早期结核检出率， 实现临床对结核疾病的早诊早治， 提高临床治愈率。
参考文献
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[5]王旭洲， 谢飞来， 郑智勇. 荧光定量PCR检测结核/非结核分枝杆菌在肉芽肿病理诊断中的应用. 临床与实验病理学杂志， 2013， 29（8）：884-887.
[6]Agarwal A. Comparative Evaluation of BacT/ALERT 3D Culture Medium and Nested PCR in the Diagnosis of Tuberculous Meningitis. Saarc Tuberculosis & Hiv/aids Centre， 2015（11）：15-20.
[7]杨铭， 岳冀， 李曦， 等. 纤维支气管镜在支气管结核诊断中的应用价值分析. 四川医学， 2012， 33（8）：1394-1395.
[收稿日期：2017-03-30]